中草藥對弧菌的抑制作用研究論文
摘 要：目的 闡明現(xiàn)常用抑菌中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的用藥療效，為水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疾病的防治提供用藥參考。方法 采用微量肉湯稀釋法測定了12種水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的抗菌中藥產(chǎn)品對5株常見海洋致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。結果 NZ方與市售“蝦倍健”抑菌效果最佳，對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌的最低抑菌濃度在0.313～1.250 g/L，而其他市售抗菌中草藥大黃末、六味黃龍散、三黃散、根蓮解毒散、七味板藍根散、大蒜素、病毒速滅亡、穿梅三黃散、白頭翁口服液、健肝寶和地錦草末對5種海洋致病菌抑制濃度均大于40.000 g/L。 結論 給水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疾病的防治提供了用藥建議及使用參考。
關鍵詞：NZ方; 弧菌; 中草藥
近年來，隨著對蝦疾病的爆發(fā)越來越頻繁，我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)特別是華南地區(qū)的對蝦養(yǎng)殖受病害肆虐情況嚴重，部分地區(qū)對蝦幼體患病死亡率達100%，給殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，如何有效防治對蝦病害侵襲也倍受水產(chǎn)業(yè)界人士關注和重視[1-2]。蝦的紅體、偷死、肌肉白濁、爛眼爛鰓、熒光、黑斑等癥狀多由弧菌及嗜水氣單胞菌引起，而根據(jù)上述病癥，農(nóng)業(yè)部“用藥指導”也給出相關的用藥建議。其中，大黃末、地錦草等被廣泛推薦應用。根據(jù)現(xiàn)行國家標準，抗菌類中藥制劑有38種，筆者選取其中最為常用的.12種中藥制劑與NZ方對5株常見的海洋致病菌進行體外抑菌作用的比較，為水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疾病的防治提供用藥參考。
1 材料與方法
1.1 菌株
標準菌株：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuss，V.p);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，V.a);哈維氏弧菌(Vibro harveyi，V.h);創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，V.v);嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，A.h)由中國南海研究所提供。
1.2 培養(yǎng)基
2216E 液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司)。2216E瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司)。
1.3 藥物及其制備
NZ方(檵木葉、半邊蓮花、地膽草等8味)：由中藥開發(fā)研究所研制。大黃末：每1 kg飼料用本品5.0 g;六味黃龍散：每1 kg飼料用本品4.0 g。三黃散：每1 kg飼料用本品5.0 g;根蓮解毒散：每1 kg飼料加本品10.0 g。七味板藍根散;每1 kg飼料用本品2.5 g;大蒜素：每1 kg飼料用本品0.6 g。蝦倍健：每1 kg飼料用本品4.0 g;病毒速滅亡：每1 kg飼料，用本品20 mL。穿梅三黃散：每1 kg飼料用本品4.0 g;白頭翁口服液：每1 kg飼料用本品3 mL。健肝寶：每1 kg飼料用本品2.0 g;地錦草末：每1 kg飼料用本品10.0 g。分別取上述藥物16.0 g制備成100 mL藥液。
1.4 儀器
儀器：分析天平(BT211B，德國Sartorius公司);手提式壓力蒸汽滅菌鍋(OIJ2006-04，上海東亞壓力容器制造有限公司);雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。
1.5 藥物配制
將受試藥物用適宜溶劑配制成0.8 g/ mL的藥液，高壓滅菌后，按二倍遞減濃度稀釋，共配制成11個梯度濃度的藥物稀釋液。
1.6 菌種復蘇與培養(yǎng)
將冷藏保存的菌種在瓊脂板上劃線培養(yǎng)復蘇24 h，再挑取生長良好的單菌落接種到裝有2216E肉湯培養(yǎng)基的搖菌管中，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期。
1.7 測量
以2216E肉湯作為空白對照液調零，在波長600 nm處測定菌懸液OD值，計算含菌數(shù)，并稀釋成1×106 CFU/ mL的菌懸液。
1.8 加樣孵育
按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μl于96孔板第1-11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μl作陰性對照，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h。
1.9 結果判讀
肉眼觀察，藥物最低濃度孔無細菌生長者，即為該試菌MIC值。難判斷者，可將該孔中培養(yǎng)液于無菌瓊脂板上劃線，37 ℃培養(yǎng)20 h后讀取結果。
2 結果與分析
NZ方與12種市售抑菌中藥品對5種危害較大的海洋致病菌的最低抑菌濃度的測定結果可知，蝦倍健抑菌濃度最低，抑菌效果最佳，對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌的最低抑菌濃度為0.313 g/L;對哈維弧菌、溶藻弧菌的最低抑菌濃度為1.250 g/L;穿梅三黃散次之，在5.000～40.000 g/L;而大蒜素、病毒速滅亡、根蓮解毒散的抑菌效果最差，均在40.000 g/L以上，見表1。
對12種藥品與NZ方的最低抑菌濃度及其標示用量進行比較，其中僅有蝦倍健標示用量大于最低抑菌濃度，也就是說，按產(chǎn)品標示用法用量，僅有蝦倍健能達到預期抑菌效果，見表2。
3 討論
根據(jù)上述研究結果顯示，市面上抗菌藥物種類繁雜，而養(yǎng)殖戶面對細菌感染疾病的爆發(fā)卻無可奈何，盲目用藥，直接損害了養(yǎng)殖戶的利益[6-7]。在筆者隨機選取的10余種常用抗菌中藥的實驗結果看來，情況令人堪憂，這些在養(yǎng)殖過程中的應用十分廣泛的藥品，在對其進行的最低抑菌濃度試驗中其最低抑菌濃度根本無法達到抑菌防治效果[8]。
隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖的廣泛使用。近年來，耐藥菌的不斷產(chǎn)生，養(yǎng)殖戶對細菌性疾病的爆發(fā)束手無策，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的損失，中草藥以其安全、副作用小、無耐藥性等獨特的優(yōu)勢，逐漸成為研究和開發(fā)的熱點，市面上標榜抗菌的中草藥五花八門，但加工粗糙，質量良莠不齊，夸大藥效，導致養(yǎng)殖戶用藥無效，對中草藥產(chǎn)品失去信心[9-11]。
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