Beclin1基因研究論文
Beclin1基因也稱BECN1基因，是一種自噬相關基因，它與Bcl-2基因相互拮抗調控自噬。自噬是細胞中初級溶酶體處理內源性底物的重要過程，同時參與維持細胞內蛋白代謝平衡及內環(huán)境穩(wěn)定的維持，在清除廢物、結構重建以及細胞生長發(fā)育中起重要作用。近來Ⅱ型程序性細胞死亡-自噬性細胞死亡研究迅速受到人們的關注。自噬曾被Science評為全球科技領域6個研究熱點之一。然而自噬性細胞死亡研究主要集中在腫瘤學領域，在寄生蟲學領域還很少得以開展，目前已有關于自噬在弓形蟲感染致病中的作用的研究報道，其中一種觀點認為細胞自噬通過降解作能清除進入胞內的弓形蟲保護正常細胞不被感染，另一種觀點認為自噬參與弓形蟲感染復制過程，抑制了宿主細胞自噬就抑制了弓形蟲的增殖。然而關于細胞自噬在弓形蟲感染致病過程中的具體作用，自噬途徑能否成為抗弓形蟲治療的新靶點等還有待于深入研究。
本研究擬構建Beclin1基因的真核表達載體并通過脂質體介導的方法將外源性Beclin1基因導入293T細胞，再以Western blot的方法驗證其在真核細胞內的表達，為進一步探索外源性Beclin1基因對弓形蟲生長、增殖及新的致病機制等提供基礎資料。
材料與方法
1.材料
1.1 細胞和載體
293T細胞和真核表達載體pEGFP均由安徽醫(yī)科大學病原生物學教研室保存。
1.2 主要試劑及儀器
質粒小量提取試劑盒為美國Axygen公司產品，Trizol試劑和Lipo2000為美國Invitrogen公司產品;BamHⅠ、EcoRⅠ和rTaq mix為日本TaKaRa公司產品;逆轉錄試劑盒為美國Fermentas公司產品;DNA 膠回收試劑盒為德國QIAGEN公司產品;鼠抗pEGFP為英國Abcam 公司產品;HRP標記山羊抗鼠IgG為北京全式金公司產品。
2.方法
2.1 RT-PCR擴增目的基因
根據Trizol試劑說明書提取293T細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒步驟將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，以beclin1基因編碼區(qū)全長擴增引物Beclin1-F(5′-CGGAATTCTATGGAAGGGTCTAAGACGTCC-3′)和Beclin1-R (5′-CGGGATCCTCATTTGTTATAAAATTGTGAGGACA-3′)，進行PCR 反應。取PCR產物5μl，用含EB的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，分析PCR擴增結果，按DNA膠回收試劑盒的說明進行目的片段的回收和純化。
2.2 PCR 產物和載體pEGFP的酶切及純化
取PCR產物10μl，用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切反應，根據DNA 膠回收試劑盒說明進行酶切片段的回收和純化。
2.3 Beclin1基因與pEGFP的重組與鑒定
將雙酶切后膠回收的Beclin1和pEGFP按摩爾比3～10︰1的比例用1μl T4連接酶于16℃連接過夜，將連接產物轉化大腸埃希菌DH5α并進行培養(yǎng)，從培養(yǎng)12h～16h的卡那抗性培養(yǎng)平板上挑取若干單克隆，分別放入3ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃以200r/min振搖過夜，按照質粒提取試劑盒說明提取質粒。采用雙內切酶切法和PCR法鑒定重組基因，雙酶切、PCR鑒定正確的重組表達質粒送上海生工公司測序，并進行Blast比對分析。
2.4 Beclin1基因在真核細胞內的表達
通過脂質體介導的方法分別將空載體pEGFP和pEGFP-Beclin1重組質粒轉染到293T細胞內，24h后用熒光顯微鏡觀察轉染情況，提取轉染后細胞總蛋白，采用Westernblot檢測Beclin1基因編碼蛋白的表達情況。
結 果
1 目的基因Beclin1PCR擴增提取293T 細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，用Beclin1基因全長擴增引物Primer-F和Primer-R擴增得到Beclin1基因全長編碼區(qū)片段，大小為1 353bp，與預期值一致。
2 pEGFP-Beclin1重組載體pEGFP-Beclin1的鑒定pEGFP-Beclin1經過限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到1 353bp目的基因片段和約4 700bp的載體pEGFP片段，經上海生物工程試劑公司測序，測序結果經Blast比對與beclin1基因序列同源性為100%。
3 Beclin1蛋白在真核細胞內的表達用LiPo 2000分別介導pEGFP和pEGFP-Beclin1轉染293T細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光;Western blot檢測出目的`蛋白，大小與預測一致。
討 論
弓形蟲病是由專性細胞內寄生的弓形蟲引起的人獸共患寄生蟲病，在世界各地普遍流行。患弓形蟲病的孕婦可能將弓形蟲傳染給胎兒，尤其當感染發(fā)生在妊娠頭3個月，可引起流產，甚至死胎，或生下發(fā)育缺陷的患兒，已被列為感染性致畸(TORCH)綜合征主要原因之一。對于免疫功能嚴重損害或抑制者，弓形蟲同樣是引起致死性病變的主要病原體之一。近年來隨著人們生活水平的提高，飲食習慣的改變，食物來源的多樣化，飼養(yǎng)寵物的人數的增多，弓形蟲感染呈上升趨勢。傳統的抗弓形蟲藥物包括乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等毒副作用較大，用藥時間長，只能殺死速殖子，停藥后易復發(fā)，因而限制了其應用，至今仍缺少理想的治療弓形蟲病藥物。
近年來，細胞自噬成為研究的熱點，Beclin1基因作為自噬相關基因倍受青睞。本實驗構建了pEGFP-Beclin1重組載體并檢測到該基因編碼的蛋白在真核細胞內表達，為深入探索beclin1基因在弓形蟲感染致病作用中的影響，了解弓形蟲新的致病機制以及弓形蟲病的預防和治療打下了基礎。
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